前面我們談到了來自基因組暗物質(zhì)神秘的非編碼長鏈RNA（lncRNA）、非編碼環(huán)形RNA（ciRNA）、微小的RNA（miRNA），現(xiàn)在我們再來談談與微小的RNA（miRNA）有密切關系的小干擾RNA（siRNA）和短發(fā)夾RNA（shRNA）。介紹他們之前我們需要先了解下RNA干擾（RNAi）技術。

RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是有效沉默或抑制目標基因表達的過程，指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應的功能表型缺失的現(xiàn)象。RNA干擾由轉(zhuǎn)運到細胞細胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活。沉默機制可導致由小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）誘導實現(xiàn)靶mRNA的降解，或者通過小RNA（miRNA）誘導特定mRNA翻譯的抑制。通過短反義核酸（siRNA和shRNA序列）鎖定細胞mRNA，從而實現(xiàn)其隨后的降解。這反過來阻斷了該蛋白的進一步表達/聚集，導致其水平的下降，最終實現(xiàn)抑制作用。

RNA干擾最初是怎樣發(fā)現(xiàn)的呢？我們也簡單回顧下：

早在1984年人們就發(fā)現(xiàn)反義RNA能夠抑制基因的表達，但后來人們發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA在抑制基因表達方面實際上比單鏈RNA更有效。RNA干擾現(xiàn)象是1990年由約根森（Jorgensen）研究小組在研究查爾酮合成酶對花青素合成速度的影響時所發(fā)現(xiàn)的，為得到顏色更深的矮牽?；ǘ^量表達查爾酮合成酶，結(jié)果意外得到了白色和白紫雜色的矮牽?；?，并且過量表達查爾酮合成酶的矮牽牛花中查爾酮合成酶的濃度比正常矮牽?；ㄖ械臐舛鹊?0倍。約根森推測外源轉(zhuǎn)入的編碼查爾酮合成酶的基因同時抑制了花中內(nèi)源查爾酮合成酶基因的表達。1992年，羅馬諾（Romano）和Macino也在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)了外源導入基因可以抑制具有同源序列的內(nèi)源基因的表達。1995年，Guo和Kemphues在線蟲中也發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。1998年，安德魯·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀麗隱桿線蟲（C.elegans）中進行反義RNA抑制實驗時發(fā)現(xiàn)，作為對照加入的雙鏈RNA相比正義或反義RNA顯示出了更強的抑制效果。從與靶mRNA的分子量比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強于理論上1:1配對時的抑制效果，因此推測在雙鏈RNA引導的抑制過程中存在某種擴增效應并且有某種酶活性參與其中。并且將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾。

RNA干涉（RNAi）在實驗室中是一種強大的實驗工具，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導序列特異的目標基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對特定信使RNA（mRNA）進行降解的指導要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應所必需的因子。

siRNA和shRNA的作用機制

兩個在RNAi途徑的基因沉默中具有實質(zhì)利害關系的是雙鏈小干擾RNA（siRNA）和基于載體的短發(fā)夾RNA（shRNA）。雖然siRNA和shRNA（圖1）都可用于蛋白沉默，但它們的作用機制有所不同（圖2）。不管是長的雙鏈RNA還是短的約21bp堿基對的雙鏈都能夠直接被轉(zhuǎn)運到組織培養(yǎng)的細胞中。雖然有一些報道提到siRNA在轉(zhuǎn)染細胞時是被轉(zhuǎn)運到細胞核中的，但更普遍的看法是它們在細胞質(zhì)中聚集。長的雙鏈RNA與Dicer一起形成復合物，雙鏈特異性的核糖核酸酶III能夠?qū)⑺鼈兲幚沓蓭в袃蓚€游離堿基的長度為21-23nt的siRNA。隨后這些siRNA片段與RISC結(jié)合，RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-結(jié)合蛋白（TRBP）組成。然后RNA的兩條鏈分開，其中一條鏈從復合物上分離。5'端雙鏈穩(wěn)定性最低的那條鏈被選擇出來，穩(wěn)定的并入沉默復合物中。shRNA在轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導細胞的細胞核中的合成，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，莖區(qū)成對的反義和正義鏈與未配對的成環(huán)核苷酸連接在一起（圖1b和1c）。通過與miRNA的加工相同的RNAi機制，shRNA被加工成siRNA。使用細菌或病毒載體，shRNA被導入靶細胞的細胞核內(nèi)，在某些情況下，載體可以穩(wěn)定地整合到基因組中。根據(jù)驅(qū)動表達的啟動子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化轉(zhuǎn)錄。在被Exportin-5轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)之前，這些初始的前體結(jié)構(gòu)需要首先用Drosha及其雙鏈RNA結(jié)合伴侶DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA隨后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除發(fā)卡結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生在兩個3‘末端帶有兩個游離堿基的20-25nt的雙鏈siRNA。這一有活性的siRNA隨后被整合到沉默復合物上去。

圖1.siRNA和shRNA結(jié)構(gòu)。

（A）siRNAs是短的RNA雙鏈，在3‘端有兩個堿基的游離。

（B）shRNA由正義鏈和反義鏈通過環(huán)狀序列隔開共同組成。

（C）shRNA 構(gòu)建用于插入表達載體。

圖2.RNAi介導的基因沉默機制。在細胞核表達后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，在細胞質(zhì)中它們與Dicer結(jié)合去除環(huán)狀序列。在這一點上，它們與siRNA的加工方式（以短的雙鏈形態(tài)導入細胞，然后被Dicer識別）相同。在與RISC結(jié)合并去掉其中一條RNA鏈后，它們識別mRNA占有互補序列，導致其降解。

一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA識別靶mRNA和降解的過程基本上是相同的。作為RISC的一部分，siRNA通過堿基互補配對以序列特異性的方式結(jié)合到靶mRNA，從而利用Ago-2的核酸酶H樣活性裂解靶RNA的雙鏈中心附近的磷酸骨架。某些生物的這個系統(tǒng)有一個有趣的特點，siRNA與靶mRNA的退火使siRNA作為引物，而靶mRNA作為依賴于RNA的RNA聚合酶的模板。這就合成出一個新的雙鏈RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反饋循環(huán)，增加了siRNA的量。應當指出的siRNA通常需要完全同源才能誘導降解。

miRNA與siRNA的相同點和區(qū)別

miRNA與siRNA之間有許多相同之處：

1.二者的長度都約在22nt左右。

2.二者都依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點。

3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。

4.二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導沉默機制上有重疊。

5.miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。

miRNA與siRNA的不同點：

1.根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而siRNA是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。

2.結(jié)構(gòu)上，miRNA是單鏈RNA，而siRNA是雙鏈RNA。

3.Dicer酶對二者的加工過程不同，miRNA是不對稱加工，miRNA僅是剪切pre-miRNA的一個側(cè)臂，其他部分降解；而siRNA對稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。

4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶標基因3′-UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。

5.在作用方式上，miRNA可抑制靶標基因的翻譯，也可以導致靶標基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用，而siRNA只能導致靶標基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。

6.miRNA主要在發(fā)育過程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達，而siRNA不參與生物生長，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。

RNAi 技術要點

1.siRNA 的設計

RNAi 技術要求siRNA 反義鏈與靶基因序列之間嚴格的堿基配對, 單個堿基錯配就會大大降低沉默效應, 而且siRNA 還可以造成與其具同源性的其它基因沉默(也叫交叉沉默) , 所以在siRNA 的設計中序列問題是至關重要的。要求所設計的siRNA 只能與靶基因具高度同源性而盡可能少的與其他基因同源。設計siRNA 序列應注意以下幾點: ①從靶基因轉(zhuǎn)錄本起始密碼子AUG 開始, 向下游尋找AA 雙核苷酸序列, 將此雙核苷酸序列和其下游相鄰19 個核苷酸作為siRNA 序列設計模板; ②每個基因選擇4～5 個siRNA 序列, 然后運用生物信息學方法進行同源性比較, 剔除與其他基因有同源性的序列, 選出一個特異性最強的siRNA; ③盡量不要以mRNA 的5'端和3'端非翻譯區(qū)及起始密碼子附近序列作為設計siRNA的模板, 因為這些區(qū)域有許多調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(如翻譯起始復合物) , 調(diào)節(jié)蛋白會與RISC 競爭結(jié)合靶序列, 降低siRNA 的基因沉默效應。

2.siRNA 的合成

目前獲得siRNA 主要有體外制備和體內(nèi)表達兩種方式。

2.1.體外制備

2.1.1.化學合成

許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。

最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究

不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素

2.1.2.體外轉(zhuǎn)錄

以DNA Oligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。

最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。

不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。

2.1.3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。

最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型

不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療

在體外(in vit ro) 可用不同的方法將siRNA導入靶細胞, 一般來講化學合成和體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA 可用電轉(zhuǎn)移(elect roporation) 、微注射和轉(zhuǎn)染的方法引入細胞。而表達質(zhì)粒則常通過轉(zhuǎn)染的方法導入靶細胞然后再表達siRNA。向體內(nèi)(in vivo) 導入siRNA 的研究工作也已有報道, 如有研究者用靜脈注射的方法將合成的siRNA 引入動物體內(nèi)進行基因功能的研究。

2.2體內(nèi)表達

前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。

2.2.1.siRNA表達載體

多數(shù)的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。

病毒載體也可用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。

最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。

不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。

2.2.2. siRNA表達框架

siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECS)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究。

這個方法的主要缺點是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結(jié)果不理想。

最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子

不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

RNA干擾（RNAi）技術的應用

RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究的重要工具。大多數(shù)藥物屬于標靶基因（或疾病基因）的抑制劑，因此RNAi 模擬了藥物的作用，這種功能丟失（LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得（GOF)方法更具優(yōu)勢。因此, RNAi 在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標確認的一個重要工具。同時，那些在靶標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進一步開發(fā)成為RNAi藥物。

在藥物標靶發(fā)現(xiàn)和確認方面，RNAi技術已獲得了廣泛的應用。生物技術公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫來引入細胞，然后通過觀察細胞的表型變化來發(fā)現(xiàn)具有功能的基因。如可通過RNAi文庫介導的腫瘤細胞生長來發(fā)現(xiàn)能抑制腫瘤的基因。一旦所發(fā)現(xiàn)的基因?qū)儆诳捎盟幍陌袠耍ㄈ绫磉_的蛋白在細胞膜上或被分泌出細胞外），就可以針對此靶標進行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標還可用RNAi技術在細胞水平或動物體內(nèi)進一步確認。

在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用于臨床測試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、肥胖癥等。在抗病毒治療方面，帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)開始初步采用RNA干擾療法。腫瘤治療方面也已經(jīng)取得了一些成果。