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280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。 A230 測定其它碳源物質(zhì)，如酚，糖類等； A260 是核酸的吸收峰測 RNA 和 DNA，引物等的濃度用的； A280 是蛋白質(zhì)的吸收峰。 一般的，我們只看 OD260/OD280（Ratio，R）——1.8~2.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當用 Tris 作為緩沖液檢測吸光度時，R 值可能會大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當 R<1.8時，溶液中蛋白或者其他有機物的污染比較明顯，你可以根據(jù)自己的需要決定這份RNA的命運。當 R>2.2時，說明 RNA 已經(jīng)水解成單核酸了。 純RNA 的A260/A280的比值為 2.0。 OD260/OD230的比值還表明 RNA 的純度——其值 <2.0 表明裂解液中有亞硫氰胍和β-巰基乙醇殘留，其值>2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀 RNA。 附： 260/230的值，一般不要小于2.0，小的話表明有異硫氰酸胍，β-巰基乙醇或乙醇的殘留。補救的方法是再沉淀一次，然后重復(fù)乙醇洗滌的過程。但從我的經(jīng)驗看，后面RNA丟得很多……因此提RNA時就注意了 個人經(jīng)驗，260/230偏小的話，提取時可以改進以下幾點： 1.加氯仿抽提后取少一點上清，不要貪多。 2.加乙醇洗的時候，多晃幾次，盡量讓RNA沉淀整片懸浮起來（有時候確實浮不起來也沒辦法。） 3.棄乙醇的時候，用槍吸而不是傾倒，倒的話經(jīng)常有液滴留在管壁上，倒不干凈。第一次用藍槍頭吸，可以不完全吸干，免得吸到沉淀；然后短暫離心把殘余酒精甩到管底，看準了用白槍頭盡量吸干凈。RNA量大，被白槍頭弄掉一點也沒關(guān)系。 4.溶解前晾干的時間可以長一點，5分鐘也沒關(guān)系的。標準的做法說是不能晾太久，等沉淀開始變透明就要加水溶解，但是我晾過10分鐘的，后面RNA量也很大?？赡芰看螅m然有些溶解不了，最后濃度還是高。 可能不完全正確，但是以前我出現(xiàn)過260/230偏小的問題，按上面方法改進了操作，后面就好了。 還有一種原因可能是多糖類雜質(zhì)殘留，可試試用LiCl沉淀。 RNA溶液的 |
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